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Protocolo para a determinação da atividade da ECA
O ensaio, para a medida da atividade proteolítica da enzima conversora de angiotensina I (ECA-I), empregando os substratos FRET Abz_FRK(Dnp)P-OH, Abz-SDK(Dnp)P-OH e Abz-LFK(Dnp)-OH tem a vantagem de ser rápido, extremamente sensível e descomplicado. Estes substratos FRET para ECA-I são ideais para os estudos em cinéticas enzimáticas e para a análise da atividade somática ou seletiva dos domínios C e N de ECA-I. Os ensaios podem ser realizados diretamente em cubeta e a hidrólise monitorada pelo registro contínuo por 5 a 10 minutos.
MATERIAIS
Reagentes:
• Substratos FRET: Abz-FRK(Dnp)P-OH, Abz-SDK(Dnp)P-OH e Abz-LFK(Dnp)-OH.
• Tampão de ensaio: 0,1 M Tris.HCl, pH 7,0 com 50 mM NaCl e 10 ųM ZnCl2 (ver preparação dos reagentes).
• Dimetilsulfóxido - DMSO
• Inibidores específicos de ECA: Captopril ou Lisinopril.
• Inibidores usados para dosar ECA em tecidos: trans-epoxy-succinyl-L-leucylamido-(4-guanido)-butene (E-64), phenyl-methylsufonyl fluoride (PMSF), pepstatin, N-tosyl-L-phenylalanyl-chloromethyl ketone (TPCK), N-tosyl-lysyl-chloromethyl ketone (TLCK).
• Reagente de Bradford.
• Albumina Bovina para ser usada como padrão.
• ECA purificada de pulmão de coelho.
Equipamentos:
• Espectrofluorímetro com célula com temperatura controlada e agitador
• Banho com circulação e temperatura controlada adaptado para o espectroflurímetro.
• Cubeta de quartzo
• Barra magnética PTFE-coated
• Espectrofluorímetro de microplaca automático equipado com controlador de temperatura e shaker.
• Placa de 96 poços de poliestireno preta.
• Grafit versão 5.0 (Erithacus Software Ltda).
Preparação dos Reagentes:
• Solução estoque de peptídeos FRET: Dissolver 1 mg do peptídeo em 100% DMSO. Esta solução pode ser preparada com antecedência e estocada a 4oC por 6 meses.
• Tampão de ensaio: Dissolver 12,1 g de Tris.Base, 2,92 g de NaCl e 1.36 mg de ZnCl2 em 1 litro de água deionizada. Ajustar o pH para 7,0 com HCl. Esta solução pode ser estocada por 2 meses a 4oC.
• Inibidores: 1 mM de lisinopril ou 1 mM de captopril preparados com água deionizada. Estas soluções podem ser estocadas a -20oC por 1 ano.
PROTOCOLO
Preparação da solução estoque dos peptídeos FRET:
1. Preparar a solução estoque dos peptídeos FRET em 100% de DMSO. (em geral, solução de 1 mg ml-1).
2. Usar 4 diferentes volumes da solução estoque do peptídeo para a construção da
curva padrão e para a determinação da concentração pelo espectrofotômetro,
utilizando o comprimento de onda de 365 nm e o coeficiente de extinção molar do
grupo Dnp,
 365= 17,300 M-1.cm-1.
3. Uma reta representa a dependência entre a absorbância e a concentração do substrato. O coeficiente angular da reta servirá para obter a concentração de substrato no ensaio em termos de ųM.
Conversão de unidades arbitrárias de fluorescência (UAF) em micromoles:
4. Usar 1 ųM de Abz-FRK(Dnp)P-OH, de Abz-FRK(Dnp)P-OH (com a concentração determinada conforme descrito nas etapas de 1 a 3), para determinar o sinal da fluorescência do segmento Abz-FR-OH, resultante da hidrólise total do peptídeo.
5. Colocar a cubeta no compartimento com temperatura controlada do espectrofluorímetro, sob agitação, utilizando uma barra magnética. Adicionar o tampão de ensaio (ver preparação dos reagentes) e 1ųM de Abz-FRK(Dnp)P-OH (com a concentração determinada conforme descrito nas etapas de 1 a 3).
6. Esperar cerca de 5 minutos até a temperatura atingir 37oC, com agitação constante do substrato na cubeta. Adicionar 3 ųl de ECA purificada de pulmão de coelho (1U ml-1) em um volume final de 1 ml. Registrar continuamente o aumento da fluorescência com o tempo ( ex = 320 nm,
em = 420 nm) até atingir a hidrólise total (velocidade de hidrolise=0), a fluorescência se torna constante.
7. Este valor representa a hidrólise total do peptídeo, corresponde a fluorescência de 1 ųM de Abz detectado pelo espectrofluorímetro ( levando em conta o caminho percorrido e a largura da fenda), o que permite a conversão de unidades arbitrárias de fluorescência (UAF) em micromoles de peptídeo hidrolisado.
Passo Critico: A calibração do espectrofluorímetro dever ser feita mensalmente.
Determinação da atividade da ECA:
8. Para a ECA purificada, seguir a opção (A), para a ECA no plasma, seguir a opção (B) e para a ECA em tecido, seguir a opção (C).
(A) Enzima Purificada:
(i) Colocar a cubeta contendo a mistura do tampão de ensaio (ver preparação dos reagentes) e o substrato FRET na célula com temperatura controlada do espectrofluorímetro. Aguardar cerca de 5 minutos para a temperatura atingir 37oC. A agitação da mistura deve ser constante por meio de uma barra magnética. Durante este tempo não dever ser observada nenhuma mudança significativa na leitura da fluorescência.
(ii) Adicionar amostras de ECA purificada (1 a 50 ųl) na cubeta. Registrar continuamente o aumento da fluorescência com o tempo (ex = 320 nm,
em = 420 nm), mantendo a temperatura a 37oC e em agitação constante.
(iii) A velocidade de hidrólise deve ser linear e constante (5 a 10 minutos é o suficiente para estabelecer uma velocidade de hidrólise). A velocidade expressa em UAF min-1 deve ser convertida em micromol de substrato hidrolisado por minuto (baseado na hidrólise total do peptídeo, como descrito nas etapas de 4 a 7). O volume final pode variar de 0,35 a 2,0 ml.
(iv) Para a determinação do km, usar pelo menos cinco diferentes concentrações de substrato. A velocidade de hidrólise depende da concentração do substrato, isso é estabelecido nas velocidades iniciais, que deve ser constante e não ultrapassar 5% da concentração total de substrato. A avaliação da cinética é feita através da utilização das velocidades iniciais na equação de Michaelis-Menten no “nonlinear least-square regression” do programa Grafit.
(B) ECA no Plasma:
(i) O sangue tratado com heparina deve ser centrifugado a 1000g por 10 minutos a 4oC.
(ii) O plasma deve ser separado e estocado.
(iii) Colocar a cubeta contendo a mistura do tampão de ensaio (ver preparação dos reagentes) com 10 ųM de Abz-FRK(Dnp)P-OH na célula com temperatura controlada do espectrofluorímetro. Aguardar cerca de 5 minutos até a temperatura atingir 37oC. A agitação da mistura deve ser constante, utilizando uma barra magnética. Durante este tempo não dever ser observada nenhuma mudança significativa na leitura da fluorescência.
(iv) Adicionar 1 a 10 ųl do plasma na cubeta. Registrar continuamente o aumento da fluorescência com o tempo (ex = 320 nm,
em = 420 nm), mantendo a temperatura a 37oC e sob agitação constante. O volume final pode variar de 0,35 a 2,0 ml.
(v) O coeficiente angular deve ser convertido em nanomoles de substrato hidrolisado por minuto (baseado na curva de calibração obtida da hidrólise total do peptídeo, como descrito nas etapas de 4 a 7). A atividade da ECA pode ser expressa como nmol por min por ml de plasma (1 mU = nmol de Abz-FRK(Dnp)P-OH hidrolisado por minuto).
(C) ECA em tecidos homogeneizados:
(i) As amostras de tecido devem ser rapidamente colhidas, lavadas, e homogeneizadas em tampão Tris.HCl, pH 7,0, com 50 mM NaCl.
(ii) O tecido homogeneizado deve ser centrifugado a 1000 g por 10 minutos a 4oC. Conservar o sobrenadante.
(iii) Medir a concentração de proteína das amostras utilizando o ensaio de Bradford, com albumina bovina como padrão.
(iv) Colocar a cubeta contendo a mistura do tampão de ensaio (ver preparação dos reagentes) e o substrato FRET na célula com temperatura controlada do espectrofluorímetro. Inibidores específicos para cada classe de protease (10 ųM de E64, 1 ųM de pepstatina, 100 ųM de PMSF, 100 ųM de TLCK e 100 ųM de TPCK) também devem ser adicionados para prevenir hidrólise inespecífica. Esperar cerca de 5 minutos para a temperatura tingir 37oC, a agitação da mistura deve ser constante, utilizando uma barra magnética. Durante este tempo não dever ser observada nenhuma mudança significativa na leitura da fluorescência.
(v) A escolha do substrato deve ser: Abz-FRK(Dnp)P-OH para a leitura do domínio somático de ECA, Abz-SDK(Dnp)P-OH para o domínio N e Abz-LFK(Dnp)-OH para o domínio C e para ECA em testículo.
(vi) Adicionar o tecido homogeneizado (1 a 50 ųl). Registrar continuamente o aumento da fluorescência com o tempo (ex = 320 nm,
em = 420 nm), mantendo a temperatura a 37oC e sob agitação constante. A velocidade de hidrólise deve ser linear e constante (5 a 10 minutos é o suficiente para estabelecer uma velocidade de hidrólise).
(vii) O coeficiente angular deve ser convertido em nanomoles de substrato hidrolisado por minuto (baseado na curva de calibração obtida da hidrólise total do peptídeo, como descrito nas etapas de 4 a 7). A atividade da ECA pode ser expressa como nmol por minuto por mg de proteína ou mU por mg de proteína (1 mU = nmol de substrato hidrolisado por minuto).
(viii) Como controle negativo, o ensaio deve ser feito na presença de 0,5 ųM de inibidores específicos de ECA, captopril ou lisinopril. Nestas condições a hidrólise é completamente abolida.
Referências:
• Carmona AK, Schwager SL, Juliano MA, Juliano L, Sturrock ED.
A continuous fluorescence resonance energy transfer angiotesin I-converting enzyme assay. Nat Protoc. 2006; 1(4):1971-6.
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